骨骼的\"化学指纹\"解码术：红外-拉曼耦合技术助力大鼠股骨截面的非染色分

摘要

除骨密度外，骨质量（骨质）在预防骨质疏松症中也具有重要意义。骨骼主要由羟基磷灰石（无机成分）和胶原蛋白（有机成分）组成。通常，骨质可以通过无机/有机成分的比例（矿物基质比）以及羟基磷灰石的结晶度等指标进行系统评价。在分析技术层面，红外光谱和拉曼光谱均能够在无需染色的情况下确定骨骼成分的化学分布，并通过光谱解析获取有关骨质的信息。尽管这两种技术虽同属振动光谱范畴，但具有一定的互补性——某些类型的信息可能只能通过其中一种方法获得。

本文将介绍 AIRsight 红外拉曼显微镜在大鼠股骨截面骨质评价中的应用实例。AIRsight能够在不移动样品的情况下，对同一微小区域进行原位红外和拉曼多光谱表征，从而实现对更多成分的分析。此外，可以根据需要从红外和拉曼光谱中选择合适的分析技术，以高灵敏度检测目标组分，从而获取骨质量的特征信息。

一 实验方法

样品：大鼠股骨截面

前处理方法：使用切片机沿垂直于股骨长轴的方向对摘除后的股骨进行冷冻切片。然后，将夹具（带有切片）放置在显微镜下，以确保测定面在测定过程保持平行状态。此外，为了同时分析骨骼的无机成分和有机成分，实验中未进行脱灰处理以去除羟基磷灰石。

图1：深度测量（左）所用样品及其横截面（右）大鼠股骨截面的显微图像

所用仪器：岛津AIRsight红外拉曼显微镜（选择的拉曼激发波长为785nm）

二 测试结果

1 大鼠股骨截面的红外光谱和拉曼光谱

大鼠股骨截面的红外光谱和拉曼光谱及其主要归属如图1所示。由于本次使用的是非脱灰样品，因此同时观察到了来自胶原蛋白（酰胺I /II带）和羟基磷灰石（PO₄^3-）的特征吸收峰。值得注意的是，某些特征峰仅能通过红外光谱或拉曼光谱识别；且同一官能团在两种光谱中的强度和峰形也不尽相同。

图1：大鼠股骨截面的红外光谱和拉曼光谱

2 使用显微拉曼法进行深度测量分析

成分分布可视化：胶原蛋白和羟基磷灰石

对股骨截面进行拉曼光谱mapping成像测定，通过多元曲线分辨（MCR）法分离胶原蛋白和羟基磷灰石的组分“纯光谱”（如图2所示），并绘制浓度分布图像（如图3所示）。图中蓝色表示低浓度区域，红色表示高浓度区域。

图2：用多元曲线分辨（MCR）法分离出的组分“纯光谱”的检索结果（左：胶原蛋白；右：羟基磷灰石）

由图2可知，采用MCR法可以清晰地分离胶原蛋白和羟基磷灰石的光谱数据。化学成像图（图3）直观显示，羟基磷灰石广泛分布于骨截面，胶原蛋白则在骨内侧分布较多。

图3：基于MCR法的化学成像图（左：胶原蛋白；右：羟基磷灰石）

3 基于组分特征峰的分布特性进行骨质评价

红外/拉曼光谱的整体强度可能受样品表面状态影响。因此，本次使用各组分特征峰的比率评估成分的相对分布情况，其中蓝色表示相对浓度较低，红色表示相对浓度较高。

矿物基质比

羟基磷灰石与胶原蛋白的组分比率（PO₄^3-/ AmideⅠ）称为矿物基质比。根据已有研究，该比率随着骨骼形成时间的推移而增加。

图4：基于红外光谱峰的面积比（PO₄^3-/AmideⅠ）

如图4所示，红外光谱中磷酸盐（PO₄^3-）与酰胺I带的峰面积比分布。尽管拉曼光谱也能测量该比率，但此处选择了红外光谱数据，因其能更清晰地观察两个峰。从图4可见，骨外侧附近沿骨截面轮廓方向分布强度明显，表明该区域骨形成程度显然更彻底。

碳酸盐与磷酸盐的组分比

研究表明，羟基磷灰石中的碳酸盐（CO₃^2-）和磷酸盐（PO₄^3-）的比率会改变骨骼的溶解度，进而影响骨骼的新陈代谢（骨重塑）。

图5：基于拉曼光谱峰的面积比（CO₃^2- / PO₄^3-）

图5展示了基于拉曼光谱的CO₃^2-与PO₄^3-的峰面积比的分布情况。尽管红外和拉曼光谱法均可用于测定CO₃^2-的特征峰，但此处选择了拉曼光谱数据，因其能更清晰地分辨特征峰。从图5可见，边缘区域分布强度显著，表明该区域骨的新陈代谢活性高。

矿物成熟度

矿物成熟度是有关羟基磷灰石结晶度的指标，这里采用股骨红外光谱中1030 cm^-1和1110 cm^-1峰比值来评估矿物成熟度。红外光谱的PO₄^3- 特征峰的波数与结晶状态相关：1030 cm^-1对应于晶体结构无缺损的羟基磷灰石，1110 cm^-1是源于结晶度低的羟基磷灰石。

为了分离重叠的峰（图6），对红外光谱进行二阶微分处理。图7展示了各测定点的红外二阶导数光谱中1030 cm^-1 与1110 cm^-1的峰高比。结果显示，矿物成熟度较高的区域虽然散布在骨截面上，但相对骨截面轮廓线更靠近中央部位并成带状分布。

图6：大鼠股骨的红外光谱和二阶导数光谱       图7：基于红外二阶导数光谱的峰高比

（二阶导数光谱做了正负反转）             （1030 cm^-1 / 1110 cm^-1）

苯丙氨酸与羟基磷灰石的组分比

由于红外和拉曼光谱的选择定则不同，某些组分的特征峰在红外光谱中难以识别（无红外活性），但可通过拉曼光谱可实现有效测定。例如，苯丙氨酸、羟脯氨酸和脯氨酸等氨基酸组分的苯环呼吸振动及脯氨酸/羟脯氨酸环的C-C伸缩振动可被拉曼光谱有效识别（如图1所示）。因此，这里使用拉曼光谱成像数据，对苯丙氨酸和羟基磷灰石的组分比进行分析。

图8：基于拉曼光谱峰的面积比（苯丙氨酸 / PO₄^3-）

图8展示了苯丙氨酸与PO₄^3-的拉曼光谱峰面积比的化学成像图，高强度区域主要在骨骼外侧，推测是骨膜的影响。

本示例揭示了显微红外与显微拉曼技术选择定则的差异性，可在股骨截面分析中实现互补信息采集（弥补对特定振动模式的灵敏度不足）。因此，显微红外（μ-FTIR）和显微拉曼（μ-Raman）分析耦合的多光谱方法，可以克服单光谱方法的选择定则决定的响应弱问题，助力有机物、无机物及有机无机混合物的快速精准分析，提升定性分析的准确度。

三 结论

本文介绍了使用AlRsight红外拉曼显微镜评估大鼠股骨截面骨质特征的示例。该显微镜能够在无需移动样品的情况下，轻松测量同一位置（微小区域）的红外光谱和拉曼光谱，快速获取丰富的组分信息，从而综合表征骨质特征相关的组分比例和组分成熟度。此外，通过多变量分析方法，可以从混合物光谱中提取指定组分的光谱数据，并生成浓度分布的化学图像同时；通过对重叠峰进行导数处理，还可以进行结晶度评价。

--岛津AlRsight红外拉曼显微镜，无需移动样品，同一区域“红外拉曼双剑合璧”，追寻骨骼的"化学指纹"！---

本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。