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圣保罗大学‘路易斯·德·奎罗兹’农业学院博士后研究员玛丽安·拉波索博士 圣保罗大学‘路易斯·德·奎罗兹’农业学院博士后研究员玛丽安·拉波索博士 随着对能源安全、可持续性和全球气候变化的担忧不断增加，研究生物燃料生产作为替代化石燃料能源的热潮不断涌现。目前主要的生物燃料——生物乙醇是通过使用酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）进行酒精发酵工业生产的。然而，在发酵过程中经常观察到细菌和野生酵母的污染，这可能降低生产效率和产量。

在这篇文章中，SelectScience®采访了圣保罗大学‘路易斯·德·奎罗兹’农业学院Carlos A. Labate博士实验室的博士后研究员Mariane Raposo博士，了解她在生物乙醇生产过程中开发鉴定污染微生物策略的工作。Raposo分享了传统显微镜方法在微生物定量中的挑战，并描述了Logos Biosystems的QUANTOM Tx™是如何通过实现对细菌和酵母进行高灵敏度和准确度的几乎即时表征，从而加速了她的研究。

简化的微生物定量工作流程

为了评估鉴定微生物污染的方法，Raposo既分析工业样品，又在实验室中使用生物反应器进行实验，以模拟受控条件下的工业酒精发酵。“我的日常实验室工作包括从复杂样品中分离细菌和酵母，准备选择性培养基以获得感兴趣的微生物，并对微生物进行形态和生理分析以进行其表征，”她说。

她补充说，这个工作流程的一个关键部分是确定工业和实验室样品中存在的酵母和细菌的浓度和细胞活力。为此，她的实验室使用QUANTOM Tx™微生物细胞计数器，他们发现与传统方法相比，该仪器显著加速并简化了该过程。“以前，我们使用光学显微镜分析酵母的光学显微镜分析和在固体培养基上进行细菌的计数来确定浓度和细胞活力，” Raposo解释说。“这些技术非常耗时，需要多人准备材料和分析样品，并且为了得到细菌的结果，我们必须等待至少24小时的培养。”

“相比之下，使用QUANTOM Tx，我们能够在瞬间获得酵母和细菌的结果，而无需培养，” Raposo欣然表示，并指出该系统还避免了传统计数的固有变异性。

Logos Biosystems的QUANTOM Tx™微生物细胞计数器 Logos Biosystems的QUANTOM Tx™微生物细胞计数器 QUANTOM Tx使用自动荧光成像来识别和计数短短几分钟内的单个微生物细胞。在分析之前，样品被染色并与装载缓冲液混合，装入QUANTOM™ M50细胞计数载玻片，并在QUANTOM™离心机中旋转，使细胞均匀分布在计数室中。一旦插入载片，QUANTOM Tx会自动对焦并扫描多达10个视场以计算荧光染色的微生物细胞。然后，结果可以在触摸屏上即时验证，以图形方式查看，并保存到固态硬盘。Raposo说：“准备样品只需几分钟，整个工作流程只需要一个人从样品制备到分析。”“它的快速数据获取，无需提前准备培养基等材料以及轻松执行分析是对我们最大的优势。”

可调整的多样微生物协议

Raposo的研究重点是多种类型的细菌，包括革兰氏阳性乳酸菌和革兰氏阴性醋酸细菌，以及萨克拉曼多菌属内外的不同酵母菌株。“属于乳酸菌属的乳酸菌（LAB）是最常见的污染物，也是燃料乙醇生产产量下降的最主要原因，”她说。“在酵母中，我们主要关注酿酒酵母种的酵母株，包括负责进行酒精发酵的株以及污染株。”

根据Raposo的说法，这项工作最大的挑战之一是处理复杂的样品，并确定同一样品中存在的细菌和酵母的浓度。她分享说，这也是QUANTOM Tx特别有优势的另一个方面。该仪器采用先进的细胞检测和去聚集算法，可区分细胞形状、大小或排列方式。虽然软件经过优化以适应细菌细胞，但能够使用参数（如大小、检测灵敏度、去聚集级别和圆度）创建自定义协议，使Raposo和她的团队能够准确地区分和计数细菌和酵母菌株。

“使用QUANTOM Tx，我们能够比使用传统技术更快速、更轻松地确定样品的微生物学参数，” Raposo说。“我们有利于的是这两种微生物之间的大小和形态差异相当大，这使我们能够指导软件将细菌和酵母分开计数。”

未来展望

对能够有效产生替代化石燃料的细菌和酵母的研究正在迅速扩展，Raposo相信这一趋势将继续下去。“在这个领域正在做很多工作，”她说。“这包括获得通过将己糖和戊糖高效转化为乙醇的基因改造酵母的研究，以及鉴定能够通过有机物代谢产生生物气的细菌和古细菌的研究。”

“微生物是生产替代‘清洁’燃料的重要盟友，我很高兴看到它们的潜力在未来得到进一步的探索，”她总结说。