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如何用好岛津PDA检测器(上篇)
发布时间:2020-08-05]  阅读次数:633次


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导 语

相对于HPLC中的紫外检测器的简单操作来说,PDA检测器的使用和应用可以说是难上了级别,光源选择、狭缝、带宽、参比波长等如何选择甚是烧脑。本期我们以 SPD-M20A 检测器为例,聊一聊 PDA 检测器的使用设置和谱图解析方面的注意事项。

 

首先提出三个问题,针对这三个问题的展开介绍,使大家对PDA 检测器的有更深刻的认识:

 

• 为什么会选择使用PDA检测器,优势何在?

• 如何使用好PDA检测器。

• 如何利用PDA检测器的功能为我们提供更多的信息,更大的帮助?

 

NO.1 过人之处特殊的光路系统

 

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二极管阵列检测器(PDA)HPLC 应用中比较多的一款通用型检测器,其光路系统基本结构由光源、半透半反镜、M1 镜、滤光装置、流通池、M2 镜、狭缝、光栅、光电二极管阵列组成。

 

针对于紫外检测器来说:

1、可以实现实时多波段检测;

2、可以通过光谱图鉴别物质;

3、可以通过光谱图进行色谱峰的纯度。

 

NO.2如何找到实验合适的设置方法

 

我们使用中发现PDA参数设置是很复杂的,十分烧脑。针对PDA参数设置,提出以下建议:

设置方法前,我们面临的各项参数,首先列出各参数的设置范围及影响。

 

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通过对PDA参数的阐述,针对方法中参数设置我们提出设置建议:

 

  1. 灯的选择

使用D2灯和W灯作为光源,提供190-800nm波长范围的吸收光谱。

D2 灯使用波长范围:190-600nm

W 灯使用波长范围:371-800nm

D2+W 同时使用范围:190-800nm

 

对于仅限于紫外线区域的测量,只应使用D2 灯,根据实际的流动相比例并设置合理波长范围。

 

例如:纯甲醇为流动相,我们设置的波长范围尽量避免流动相的截止波长。

 

②光电二极管曝光时间

光源在光电二极管元件上驻留的时间,这里以单反相机举例,在光线充裕的拍照需要将底片的曝光时间缩短,否则曝光过度,底片感光饱和,照片一边白光(即 PDA 灵敏度,分辨率变差);在 夜晚或光线不足的拍照需要将底片的曝光时间延长,否则曝光不足,底片感光不足,照片模糊不清,噪点增多(即 PDA 噪音变大));PDA 可以自动调整器曝光时间,也就是在现有光强度的情况下,将光源在光电二极管元件上驻留的时间加以优化,在保证  PDA 的分辨率,灵敏度同时降低基线噪音。

 

在更换氘灯或者更换流通池是要重新调整曝光时间的,仪器时间长了光路系统老化也需要重新调整曝光时间。

 

③采样时间

测量数据按此采样时间循环输出。

作为指导性原则,分析物峰内大约30个测量点以上即可满足数量测定要求。

示例: 如果峰宽(从峰开始到峰结束的时间)是 30 秒,设定采样时间为 1 秒,则峰内有 30 个测量点。

 

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如果采样时间减少,则每单位出峰时间的测量点数量增加,也就改进了数量测定结果,保证了峰形的真实性。但是,数据文件大小也相应增加。

 

当执行快速洗脱的数量测定时,出现尖峰,采样时间应设定较小的采样时间值。

 

采样时间和曝光时间的关系1 个采样时间输出的数据是 1 个采样时间内曝光时间采集数据的平均值。

 

示例: 曝光时间 20ms,采样时间  2000ms,每 2000ms 平均输出 2000 / 20 = 100 点,这 100 点的平均值就是采样时间输出值。

采样时间的倒数是采样频率。

 

④光谱带宽

谱带宽与 PDA 检测器在检测波长处的吸光度响应息息相关,如检测波长设置为 250 nm,光 谱带宽设置为 20 nm,检测器吸光度取值处于 240-260 nm 范围内。光谱带宽设置的大小影响信噪 比、色谱峰高度、以及色谱峰表观分离度。

 

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如上图?,测量时会把246-254nm波长范围的吸光度取平均值,作为输出结果:带宽越大,噪音越低,但光谱分辨率也越低,通常设定为4

 

光谱带宽设置越大,实际检测波长范围涉及的光电二极管的个数也就越多(如带宽设置 20 nm,光电二极管分辨率  1 nm,涉及的光电二极管个数为 20 ),实际检测到的吸收度平均值以及基线噪 音也随之降低,但基线噪音降低效果更加显著。

 

随光谱带宽的增加,涉及的光电二极管数目亦会随之增加,检测器实际检测波长范围吸收度响应平均化程度也会增加,导致检测器的光谱分辨率(区别与光电二极管分辨率)降低,对依靠吸收光谱对化合物进行初步鉴别带来困难。

 

建议设置带宽为4nm

 

⑤狭缝宽度

比较窄的狭缝宽度,有利于提高PDA光电二极管的分辨率,对于依靠比对紫外吸收光谱鉴别化合物有利;比较宽的狭缝宽度,则允许更多的光透过狭缝经由光栅发生色散而被光电二极管检测到,其结果是检测到的信号强度增加,基线噪音相对减小,检测器的灵敏度增加,但伴随PDA 光电二极管的分辨率降低。

 

强调分辨率的实验:应该选择1.2nm狭缝。

强调灵敏度的实验:应该选择8nm狭缝。

 

⑥响应时间

响应时间表述的是光电二极管对于流通池内吸收度的突然变化的响应速度。响应时间设置小的时候,描绘出的色谱峰越能反映真实情况,色谱峰高度以及基线噪音同时提高 (基线噪音更加显著)。响应时间设置大的时候,色谱峰高度以及基线噪音同时减少 (基线噪音更加显著)

 

⑦参比波长

设置合适的参比波长可有效补偿流动相吸光度变化的影响,可以有效减小基线波动以及噪音水平,提高信噪比。特别是在使用HPLC梯度洗脱模式的时候,流动相随着梯度的不断变化,其吸光度亦不断改变,造成背景噪音过大。

 

参比波长设置越靠近检测波长,基线噪音水平越低,但同时会损失一定峰高。一般地,参比波长要设置为靠近检测波长但对检测组分没有吸收的波长。

设置范围建议:实际检测波长+100nm且避免样品在参比波长处有较大吸收。

 

注意:

? 建议使用参比波长在单独D2灯为光源情况下进行。如果同开启D2+W灯作为光源时,可能导致可见光波长噪音上升。

? 避免样品在参比波长处有较大吸收,影响峰高响应值。

综上所述,我们要根据实际的实验条件调整PDA参数设置,才能达到最佳的分析结果及解析结果。下期我们具体讲解,关于谱图解析和纯度计算方面的内容,感兴趣的小伙伴继续关注哦!

 

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液相工程师梁帅

 

 


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